1La solicitud médica y la toma de muestra
El diagnóstico bacteriológico comienza, en sentido estricto, antes de que la muestra llegue al laboratorio: nace en la consulta médica, con la evaluación clínica que conduce a un diagnóstico presuntivo de infección. Una solicitud médica completa —con datos del paciente, sitio anatómico específico y procedimiento de toma, diagnóstico probable, y terapia antibiótica actual o reciente— es indispensable para que el laboratorio pueda orientar correctamente el procesamiento; una solicitud incompleta compromete la calidad de todo el proceso posterior, por más riguroso que sea el trabajo técnico del laboratorio.
Los principios para una toma de muestra correcta incluyen: elegir el material que mejor represente el proceso infeccioso (muestra representativa), tomarla en el momento adecuado y, de ser posible, antes de iniciar tratamiento antimicrobiano; usar un recipiente estéril y adecuado; evitar contaminarla con la microbiota habitual del paciente; identificarla correctamente (paciente, sitio, fecha/hora); y enviarla al laboratorio lo antes posible. Las causas más frecuentes de rechazo de una muestra son: falta de rótulo, envase o medio de transporte inadecuado, demora prolongada en el envío, envase mal cerrado o muestra derramada, orina tomada directamente de la bolsa colectora, y contaminación evidente — cualquiera de estos motivos puede producir un resultado engañoso y conducir a una terapia inapropiada, por lo que la comunicación estrecha entre médico y laboratorio es indispensable en todo el proceso.
2Las muestras clínicas: qué se toma, cuándo y cómo
El fracaso en la toma de muestra es la causa más frecuente de no llegar a un diagnóstico etiológico o —peor— de sugerir uno equivocado: si la muestra no se elige y se recolecta bien, no hay procedimiento de laboratorio posterior capaz de rectificar el error. Cada sitio anatómico impone sus propias reglas, y conocerlas es tan parte del diagnóstico como leer el antibiograma.
| Muestra | Cómo se toma | Detalles que definen el resultado |
|---|---|---|
| Hemocultivo | Punción venosa con antisepsia rigurosa de la piel; se siembra directamente en el frasco de hemocultivo | Tomar 2 a 3 muestras en el pico febril y siempre antes del antibiótico. El volumen de sangre es crítico: debe respetarse la relación sangre/medio indicada por el frasco, porque la bacteriemia suele ser de baja carga y un volumen insuficiente reduce directamente la sensibilidad. La desinfección de la piel es lo que evita que un estafilococo coagulasa negativa de la flora cutánea se informe como falso positivo |
| Urocultivo | Orina de chorro medio, previa higiene genital, en frasco estéril; en pacientes con sonda se toma del dispositivo, nunca de la bolsa colectora | Requiere recuento de colonias, no solo aislamiento: la orina atraviesa la uretra distal, que tiene flora habitual, de modo que la significación del hallazgo depende de la cantidad. Suele sembrarse con ansa calibrada en agar CLDE. La orina de la bolsa colectora es causa formal de rechazo |
| Coprocultivo | Materia fecal recién emitida en frasco limpio, o hisopado rectal con medio de transporte | Es el ejemplo extremo de muestra polimicrobiana: la búsqueda del patógeno entérico exige medios selectivos-diferenciales (agar SS) que inhiban la flora colónica normal |
| LCR y líquidos de punción (pleural, ascítico, articular) | Punción lumbar o de la cavidad correspondiente, con técnica estéril, por el médico | Sitio normalmente estéril: cualquier desarrollo es significativo. Procesamiento urgente, sin refrigerar el LCR (el meningococo es lábil al frío) |
| Esputo | Expectoración profunda matinal, previo enjuague bucal; alternativas invasivas: lavado broncoalveolar (BAL) | La muestra debe representar la vía aérea baja, no saliva: se evalúa la calidad microscópica antes de sembrarla (presencia de leucocitos y escasez de células epiteliales) |
| Exudado faríngeo / nasal | Hisopo estéril; en fauces, deprimir la lengua con baja lenguas y frotar amígdalas y pared posterior evitando tocar la mucosa oral; en nariz, introducir el hisopo unos 2,5 cm contra la mucosa | Se conserva a temperatura ambiente. El objetivo es tomar del sitio de la lesión sin arrastrar flora orofaríngea acompañante |
| Abscesos, úlceras y heridas | Punción-aspiración: antisepsia con iodopovidona del centro a la periferia, dejar secar 1 minuto, punzar en el borde sano de la herida hasta el lecho, instilar 0,5 ml de solución fisiológica y aspirar | Es el mejor método por su sencillez y por evitar la flora superficial que contamina el hisopado. Se envía la propia jeringa rotulada, de inmediato. El hisopado de superficie recoge colonizantes, no al agente de la infección profunda |
| Catéter | Retiro estéril del extremo distal (punta), enviado en recipiente seco | Se interpreta junto a hemocultivos periféricos simultáneos, para distinguir colonización del catéter de infección asociada a él |
3Métodos directos e indirectos: el mapa del diagnóstico
Antes de entrar en las técnicas una por una conviene fijar la división que las organiza a todas, porque es la que permite decidir qué pedir y cómo interpretar lo que vuelve del laboratorio.
| Métodos directos | Métodos indirectos (serología) | |
|---|---|---|
| Qué demuestran | Al agente infeccioso mismo, sus componentes antigénicos, sus metabolitos o su genoma, presentes en los fluidos del paciente | La huella que el agente dejó al contactar con el sistema inmune: los anticuerpos del huésped |
| Técnicas | Observación macroscópica y microscópica (en fresco y coloraciones) · cultivo con identificación y antibiograma · detección de antígenos (aglutinación, látex, IFD/IFI, ELISA) · detección de ácidos nucleicos (PCR) | Detección de anticuerpos: ELISA, RIA, inmunodifusión, IFI, aglutinación/látex, hemaglutinación indirecta (HAI), Western blot · reacciones intradérmicas |
| Muestra típica | El material del sitio de infección (sangre, orina, LCR, secreción, biopsia) | Suero |
| Qué aportan | Diagnóstico de certeza etiológica y perfil de sensibilidad | Etapa y evolución de la infección, estado inmunológico frente al agente, respuesta al tratamiento; permite distinguir infección aguda de crónica o pasada (IgM vs IgG) |
| Limitación | Exige que el agente esté presente y sea recuperable en el momento de la toma | Hay un período ventana antes de la seroconversión; un anticuerpo positivo no siempre significa infección activa |
El tiempo es la otra variable de decisión. La observación microscópica y la detección de antígenos o ácidos nucleicos dan resultado en horas —diagnóstico presuntivo rápido, o de certeza en el caso de la PCR por su alta especificidad—, mientras que el cultivo con identificación de especie demanda 48 a 72 horas (con excepciones notables: las micobacterias tardan semanas). Esa brecha es la que justifica el tratamiento empírico inicial y su posterior ajuste cuando llega el cultivo.
4Observación microscópica: directa y de tinciones
La observación directa (muestra fresca entre porta y cubreobjetos, con objetivo de 40X) permite, en ciertas circunstancias, un diagnóstico presuntivo rápido y sencillo —por ejemplo, detectar respuesta inflamatoria en un sedimento de orina—. La observación de tinciones (con objetivo de 100X, requiere aceite de inmersión) exige primero preparar un frotis: extender el material sobre un portaobjetos formando una película delgada y homogénea, dejar secar, fijar al calor de la llama, y luego colorear.
El aumento conseguido resulta del producto del ocular por el objetivo: ocular 10X con objetivo 10X da 100 aumentos; con objetivo 40X, 400 aumentos (el que se usa en fresco); con objetivo 100X, 1000 aumentos (el de las tinciones), que exige interponer una gota de aceite de inmersión entre la preparación y el objetivo para unificar la refringencia del sistema. El microscopio óptico convencional resuelve objetos mayores a 0,2 µm, pero no es el único disponible:
| Tipo de microscopio | Fundamento | Aplicación microbiológica |
|---|---|---|
| Óptico (campo claro) | Luz transmitida; resuelve >0,2 µm | El de rutina: fresco y tinciones |
| Campo oscuro | Condensador especial: la muestra aparece muy iluminada sobre fondo negro; resuelve hasta 0,02 µm | Espiroquetas demasiado finas para teñirse con Gram — es el método de observación de Treponema pallidum en la lesión primaria (capítulo III.4) |
| Contraste de fase | Convierte diferencias de índice de refracción en diferencias de contraste | Detalles internos de microorganismos vivos, sin necesidad de fijar ni teñir |
| Fluorescencia | Fluorocromos que emiten luz al ser excitados; los microorganismos se ven brillantes sobre fondo oscuro | Auramina-rodamina para búsqueda de BAAR, inmunofluorescencia directa e indirecta para detección de antígenos |
| Electrónico | Haz de electrones en lugar de luz | Morfología viral y ultraestructura; no es método de rutina clínica |
| Tinción | Secuencia / fundamento | Uso |
|---|---|---|
| Gram | Cristal violeta (colorante principal) → lugol (mordiente, forma complejo con el colorante) → alcohol/acetona (decoloración diferencial) → safranina (contracolorante) | Separa bacterias en Gram positivas (retienen el cristal violeta, se ven violáceas) y Gram negativas (se decoloran y toman la safranina, se ven rosadas) — la tinción más utilizada en microbiología, en uso desde 1884 |
| Ziehl-Neelsen (BAAR) | Carbolfucsina básica con calor (para forzar la penetración a través de la pared rica en lípidos) → decoloración con ácido-alcohol (a la que estos microorganismos resisten, de ahí "bacilo ácido-alcohol resistente") → contracolorante azul de metileno | Micobacterias y otros microorganismos ácido-alcohol resistentes (capítulo III.5), cuya pared celular con alto contenido lipídico impide la tinción de Gram convencional |
| Otras (Giemsa, tinta china, argénticas, fluorescentes) | Variable según el colorante | Bacterias especiales, hongos capsulados (tinta china para Cryptococcus, capítulo V.3), y otros microorganismos que requieren coloraciones específicas |
5Medios de cultivo
Un medio de cultivo aporta los nutrientes (fuente de carbono, nitrógeno, hidrógeno) y las condiciones (pH, temperatura, atmósfera, humedad) necesarias para la multiplicación de microorganismos, además de permitir aumentar la biomasa celular incluso cuando la cantidad original en la muestra es demasiado escasa para observarse directamente por microscopía. Se clasifican según dos criterios:
| Por consistencia | Descripción |
|---|---|
| Líquidos | Semejan un caldo filtrado y esterilizado; se fraccionan en tubos o frascos |
| Sólidos | Un medio líquido con agregado de agar-agar (extracto de algas marinas) como agente gelificante; se funden por calor, se fraccionan en tubos o placas de Petri, y solidifican al enfriar |
| Por contenido nutricional | Descripción | Ejemplo |
|---|---|---|
| Simples | Sustancias nutritivas básicas, para bacterias metabólicamente no exigentes | Agar nutritivo |
| Enriquecidos | Medio básico con agregado de nutrientes (sangre, factores de crecimiento) para bacterias exigentes | Agar sangre, agar chocolate, caldo cerebro-corazón |
| Diferenciales | Contienen indicadores que permiten distinguir colonias según una característica metabólica, sin inhibir el crecimiento de ninguna | Agar lactosa con púrpura de bromocresol — diferencia bacterias fermentadoras de lactosa (viran el color) de las no fermentadoras |
| Selectivos | Permiten el crecimiento de un tipo determinado de bacteria, inhibiendo activamente el de otras | Agar manitol salado (Chapman) — solo crecen bacterias tolerantes a NaCl 6,5% |
| Selectivos-diferenciales | Combinan ambas propiedades: inhiben ciertas bacterias y además diferencian entre las que sí crecen | Agar SS (Salmonella-Shigella), agar CLDE (usado en urocultivos, vira de verde a amarillo si hay fermentación de lactosa, o a azul si no la hay) |
En la práctica, cada tipo de muestra tiene su batería habitual de medios. Los que conviene tener nombrados:
| Medio | Tipo | Para qué se usa |
|---|---|---|
| Agar sangre | Enriquecido y diferencial | Medio general de rutina; permite además leer el tipo de hemólisis (β completa, α parcial verdosa, γ ausente), dato central para clasificar estreptococos (capítulo III.1) |
| Agar chocolate | Enriquecido | Agar sangre calentado, que libera los factores X (hemina) y V (NAD) del glóbulo rojo; necesario para bacterias exigentes como Haemophilus y Neisseria |
| Agar MacConkey | Selectivo-diferencial | Las sales biliares y el cristal violeta inhiben a los Gram positivos; el rojo neutro diferencia bacilos Gram negativos fermentadores de lactosa (colonias rosadas: E. coli, Klebsiella) de no fermentadores (colonias incoloras: Salmonella, Shigella, Pseudomonas) — el medio de referencia para enterobacterias (capítulo III.2) |
| Agar SS (Salmonella-Shigella) | Selectivo-diferencial | Coprocultivo: inhibe la flora colónica y diferencia por fermentación de lactosa y producción de SH₂ (centro negro en Salmonella) |
| Agar CLDE | Selectivo-diferencial | Urocultivo; deficiente en electrolitos (impide el velo de Proteus). Las cepas que fermentan lactosa acidifican y viran el medio de verde a amarillo; las que no, dan colonias incoloras y viran a azul |
| Agar manitol salado (Chapman) | Selectivo-diferencial | Estafilococos: solo crece lo tolerante a NaCl 6,5%; el viraje a amarillo indica fermentación del manitol (S. aureus) |
| Thayer-Martin | Selectivo | Agar chocolate con antibióticos (vancomicina, colistina, nistatina) que suprimen la flora acompañante: aislamiento de Neisseria gonorrhoeae y N. meningitidis desde sitios contaminados (capítulo III.3) |
| Löwenstein-Jensen | Selectivo, a base de huevo | Micobacterias; incubación prolongada de hasta 6-8 semanas (capítulo III.5) |
| Agar Sabouraud | Selectivo para hongos | pH ácido y alta concentración de glucosa, habitualmente con cloranfenicol y cicloheximida para inhibir bacterias y hongos ambientales; el medio universal de la micología (capítulo V.1) |
| Caldo tioglicolato / cerebro-corazón | Líquidos de enriquecimiento | Recuperar inóculos escasos; el tioglicolato además genera un gradiente de oxígeno útil para anaerobios |
La siembra en estrías sobre el medio sólido separa progresivamente las bacterias presentes en la muestra, permitiendo obtener colonias aisladas que —al asumirse originadas de un único microorganismo— constituyen un cultivo puro, indispensable para las pruebas de identificación posteriores.
6Incubación y observación de colonias
Tras la siembra, el cultivo se incuba en condiciones óptimas de temperatura (habitualmente 35-37°C), atmósfera y tiempo (típicamente 24-48 horas). La atmósfera no es un detalle menor: los aerobios crecen al aire ambiente, pero los microorganismos exigentes como Neisseria, Haemophilus y neumococo requieren atmósfera enriquecida con 5-10% de CO₂; los microaerófilos como Campylobacter necesitan tensión reducida de oxígeno; y los anaerobios estrictos, jarras o cámaras con eliminación de oxígeno. Sembrar la muestra correcta en el medio correcto pero incubarla en la atmósfera equivocada produce un cultivo negativo indistinguible de una ausencia real de patógeno.
Una vez detectado el crecimiento, se observan las características macroscópicas de las colonias —tamaño, forma, borde, superficie, color, pigmento, olor y tipo de hemólisis en agar sangre— y se realiza una tinción de Gram a partir de una colonia aislada. Ese par de datos, morfología colonial + Gram, es el que decide qué batería de pruebas bioquímicas se aplica a continuación.
7Pruebas bioquímicas de identificación
Las pruebas de identificación son numerosas y su elección depende siempre del resultado del Gram. Cada una interroga una capacidad metabólica concreta, y unas pocas alcanzan para llegar al género o incluso a la especie.
| Prueba | Qué detecta | Cómo se lee y para qué separa |
|---|---|---|
| Catalasa | La enzima catalasa, que desdobla el agua oxigenada en agua y oxígeno | Se enfrenta una colonia con una gota de agua oxigenada: la formación de burbujas es positiva. Separa estafilococos (positiva) de estreptococos y enterococos (negativa) — la primera bifurcación de todos los cocos Gram positivos |
| Coagulasa | La coagulasa, que convierte el fibrinógeno en fibrina | Coágulo visible en plasma. Separa S. aureus (positiva) de los estafilococos coagulasa negativa — la división con mayor peso clínico dentro del género |
| Oxidasa | El citocromo c-oxidasa | El disco vira a rosado oscuro si es positiva. Positiva en Pseudomonas, Neisseria, Vibrio, Campylobacter; negativa en todas las enterobacterias (Escherichia, Proteus, Klebsiella, Salmonella) — por eso es la prueba que separa enterobacterias de no fermentadores |
| Optoquina y bilis-solubilidad | Sensibilidad a la optoquina; lisis por sales biliares | S. pneumoniae es sensible y bilis-soluble; los estreptococos del grupo viridans, resistentes e insolubles — ambos son α-hemolíticos, así que esta es la prueba que los distingue |
| Bacitracina y CAMP | Sensibilidad a bacitracina; potenciación de la β-hemólisis del estafilococo | S. pyogenes (grupo A) es sensible a bacitracina; S. agalactiae (grupo B) es resistente y CAMP positivo |
| TSI (triple azúcar hierro) | Fermentación de glucosa, lactosa y sacarosa; producción de gas y de SH₂ | Se lee pico/fondo por el viraje del rojo de fenol, más burbujas (gas) y ennegrecimiento (SH₂). Es la prueba vertebral de la identificación de enterobacterias |
| Ureasa | Hidrólisis de la urea con alcalinización del medio | Viraje a rosa fuerte. Positiva en Proteus, Helicobacter pylori y Cryptococcus; útil como marcador rápido |
| IMViC (indol, rojo de metilo, Voges-Proskauer, citrato) | Cuatro vías metabólicas leídas en conjunto | Diferencia dentro de las enterobacterias: E. coli es indol positivo y citrato negativo; Klebsiella, a la inversa |
Además de estas pruebas en tubo, el laboratorio dispone de galerías bioquímicas comerciales (tipo API) que agrupan decenas de reacciones en una sola tira y devuelven un código de identificación, de agares cromogénicos —muy útiles para visualizar poblaciones mixtas—, de aglutinación con antisueros para tipificar antígenos de superficie, y de PCR para detección genómica. El nivel taxonómico al que se llega (género, especie, subespecie, serotipo) se decide según lo que la situación clínica o epidemiológica realmente necesite.
8El circuito completo del diagnóstico bacteriológico
Integrando todo lo anterior, el esquema general —con variaciones según el tipo de muestra o el microorganismo sospechado— sigue esta secuencia: toma de muestra → observación en fresco → observación de tinciones → siembra para aislamiento primario en medios generales, selectivos y/o diferenciales → incubación en condiciones adecuadas → observación de colonias y Gram → identificación bioquímica y/o detección de antígenos o ácidos nucleicos → pruebas de sensibilidad antimicrobiana (capítulo IV.3). Este mismo esquema general, adaptado a las particularidades de cada tipo de agente, reaparece al abordar el diagnóstico de hongos (Parte V), parásitos (Parte VI) y virus (Parte VII).
Cómo se piensa
¿Por qué el laboratorio de microbiología necesita usar simultáneamente medios generales, selectivos y diferenciales sobre la misma muestra, en lugar de elegir uno solo? Una muestra clínica proveniente de un sitio no estéril (por ejemplo, materia fecal o una secreción con microbiota habitual) contiene típicamente una mezcla de múltiples especies bacterianas: la flora normal del sitio junto con el eventual patógeno causante de la infección. Sembrar esa muestra únicamente en un medio general (no selectivo) haría crecer indiscriminadamente toda la microbiota presente, produciendo una placa con decenas de colonias mezcladas donde resultaría prácticamente imposible aislar específicamente al patógeno de interés en medio de ese "ruido" microbiano. Un medio selectivo (como el agar SS para materia fecal) resuelve este problema inhibiendo activamente el crecimiento de la mayor parte de la flora intestinal habitual, mientras permite crecer preferentemente a los patógenos entéricos de interés (Salmonella, Shigella); y al ser además diferencial, distingue visualmente entre distintas colonias según sus propiedades metabólicas, orientando qué colonia específica ameritará las pruebas bioquímicas confirmatorias. Usar los tres tipos de medio en paralelo sobre la misma muestra —uno general (para no perder ningún microorganismo presente, incluidos los inesperados), uno selectivo-diferencial (para aislar específicamente al patógeno sospechado)— maximiza tanto la sensibilidad diagnóstica (detectar lo que realmente está presente) como la capacidad de aislar selectivamente al agente causal en medio de una muestra polimicrobiana.
9Trampas de examen
| Trampa | Por qué confunde | Aclaración |
|---|---|---|
| Confundir medio "selectivo" con medio "diferencial" | Ambos ayudan a distinguir bacterias en un cultivo mixto | El selectivo inhibe el crecimiento de ciertas bacterias (actúa antes del crecimiento); el diferencial no inhibe a nadie, solo permite distinguir visualmente entre las colonias que sí crecieron (actúa después, sobre la interpretación) — un medio puede combinar ambas propiedades |
| Pensar que la tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una variante menor de la tinción de Gram | Ambas son tinciones diferenciales de rutina en bacteriología | Se fundamentan en principios distintos: Gram distingue según la estructura de la pared celular (retención o no del complejo cristal violeta-lugol); Ziehl-Neelsen distingue según el contenido lipídico de la pared que resiste la decoloración ácido-alcohólica — las micobacterias, de hecho, se tiñen mal con Gram precisamente por ese alto contenido lipídico |
| Informar un urocultivo por el solo hecho de que "creció algo" | En el resto de las muestras, aislar un microorganismo suele ser el resultado buscado | La orina atraviesa la uretra distal, que tiene flora habitual: por eso el urocultivo exige recuento de colonias y no solo aislamiento. En cambio, en un sitio normalmente estéril como el LCR o un líquido de punción, cualquier desarrollo es significativo desde la primera colonia |
| Suponer que una serología positiva equivale a infección activa | El resultado "positivo" se lee como presencia del agente | Los métodos indirectos detectan anticuerpos del huésped, no al agente: una IgG positiva puede reflejar infección pasada, vacunación o inmunidad adquirida. La infección aguda se sostiene sobre IgM, seroconversión o aumento significativo del título en muestras pareadas |
| Tomar un hisopado de la superficie de una herida o úlcera para diagnosticar la infección profunda | Es la maniobra más rápida y menos invasiva | El hisopado de superficie recoge la flora colonizante del lecho, no al agente que está produciendo la infección: el método correcto es la punción-aspiración del borde sano hacia el lecho, previa antisepsia |
10Puntos clave
- El diagnóstico bacteriológico exige una solicitud médica completa y una muestra representativa, correctamente tomada, identificada y transportada: ningún procedimiento posterior corrige un error en la toma.
- Hemocultivo: 2-3 muestras en el pico febril, antes del antibiótico, respetando el volumen. Urocultivo: chorro medio y recuento de colonias. Abscesos y heridas: punción-aspiración, no hisopado de superficie. LCR y líquidos de punción: sitio estéril, cualquier desarrollo es significativo.
- Métodos directos (microscopía, cultivo, antígenos, PCR) demuestran al agente; métodos indirectos (serología) demuestran los anticuerpos del huésped. Microscopía y antígenos dan resultado en horas; el cultivo, en 48-72 h.
- Tinción de Gram (cristal violeta → lugol → decoloración → safranina) separa Gram+/Gram−; Ziehl-Neelsen tiñe BAAR (micobacterias) resistentes a la decoloración ácido-alcohólica; el campo oscuro es el método de Treponema pallidum.
- Medios de cultivo: por consistencia (líquidos/sólidos) y por contenido (simples, enriquecidos, diferenciales, selectivos, selectivos-diferenciales). Nombrados: agar sangre y chocolate, MacConkey, SS, CLDE, Chapman, Thayer-Martin, Löwenstein-Jensen, Sabouraud.
- La atmósfera de incubación importa tanto como el medio: CO₂ 5-10% para Neisseria, Haemophilus y neumococo; microaerofilia para Campylobacter; anaerobiosis estricta para anaerobios.
- Pruebas bioquímicas clave: catalasa (estafilococos vs estreptococos), coagulasa (S. aureus vs SCN), oxidasa (negativa en enterobacterias), optoquina (neumococo vs viridans), TSI e IMViC (enterobacterias), ureasa (Proteus, H. pylori).
- Circuito completo: toma de muestra → microscopía → siembra → incubación → observación de colonias/Gram → identificación → antibiograma.